2024年2月19日，慕尼黑大学医院的儿科研究团队在《Nature Methods》 （IF47.9984）上发表了题为“Generation of complex bone marrow organoids from human induced pluripotent stem cells”的突破性研究，首次向世界展示了如何利用人类iPSCs生成复杂的骨髓类器官（BMOs）。BMOs模拟骨髓微环境，具备三维结构、关键细胞类型和分子特征。它们能支持中性粒细胞分化并能响应炎症刺激反应，具有造血干细胞/祖细胞（HSPC）群和淋巴样潜能。BMOs还可用于模拟造血发育和疾病，如VPS45缺陷。为我们提供了深入理解骨髓功能和相关疾病机制的新途径。本文将与各位同好一起分享该篇文章的研究方法和研究成果。

BMOs的形成

骨髓类器官的形成是一个复杂而精细的生物工程过程，它始于人类诱导多能干细胞。这些iPSCs首先被诱导分化为胚胎体（EB），然后加入Wnt信号激动剂CHIR99021、骨形态发生蛋白4（BMP4）和血管内皮生长因子（VEGF）诱导形成中胚层。随后，通过激活素/结节信号通路抑制剂SB431542、基本成纤维细胞生长因子（bFGF）、干细胞因子（SCF）和VEGF的协同作用，进一步促进中胚层的模式化和血管内皮（hemogenic endothelium, HE）的诱导。为了促进类器官的自我组装，将模式化的胚胎体嵌入到水凝胶中，并用细胞因子刺激以产生造血前体细胞，同时维持内皮细胞的生成。研究者们于第八天在培养基中添加了低剂量的VEGF以增强血管结构的形成，并在分化的第10天将形成的胚胎体分离并转移到低附着的96孔板中，继续培养至第17天形成BMOs（图1）。

图1  iPSC衍生的BMOs的生成过程和细胞组成

BMOs模型的表征和功能分析

骨髓类器官的异质细胞类型组成是其复杂性和功能性的关键方面，通过流式数据联合 t-SNE 可视化分析，研究人员在BMOs中发现了多种细胞类型，包括造血干细胞/祖细胞（HSPCs）、内皮细胞和间充质细胞（图1）。通过免疫荧光等手段检测到BMOs中周血管基质细胞、周细胞和ECs之间的紧密相互作用（图2），这对于支持造血、维持造血干细胞功能以及协调血细胞生产所需的微环境至关重要。这些细胞类型通过自我组织形成了具有特定功能的微环境，包括支持造血干细胞（HSPCs）的维持和分化。

图2  BMOs中的间质和血管空间结构

BMOs模型的应用

在这项研究中，科学家们通过CRISPR-Cas9介导的基因编辑生成了VPS45突变BMOs模型，该基因与一种罕见的骨髓疾病——VPS45缺乏症相关。VPS45缺乏症的患者在出生后不久就会出现中性粒细胞减少症和骨髓纤维化，最终可能进展为明显的骨髓衰竭。通过在BMOs中模拟这种疾病，研究者能够在体外重现疾病的病理特征，包括骨髓纤维化和髓系细胞的增生。BMOs展现出的病理特征，如网状纤维的增加和α平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达的肌成纤维细胞样细胞的扩张，与VPS45缺乏患者骨髓活检中观察到的病理变化相似。此外，BMOs中的成熟中性粒细胞（matureNeus）亚群表现出较高的凋亡水平，这与患者体内观察到的细胞功能缺陷一致。

这种基于BMOs的疾病模型为研究疾病的发病机制提供了独特的视角，使得研究者能够在分子和细胞层面上深入理解病理过程。此外，这一模型还可以用于筛选和评估潜在的治疗策略，为开发新的治疗方法提供了可能性。通过在BMOs中测试药物对疾病表型的影响，研究者可以快速识别出可能的治疗干预点，从而加速从实验室到临床的转化过程。

图3  BMOs中造血发育和遗传疾病的建模特征

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